Pomladi 331 pr. n. št je Aleksander krenil preko Tira v Mezopotamijo. Moč njegove vojske je nekoliko oslabela zaradi namestitve vojaških posadk v osvojenih mestih, vendar pa so vojsko okrepile enote, ki so prispele iz Grčije in Makedonije. Z okrepljeno vojsko je avgusta Aleksander prečkal Evfrat in Tigris. V začetku oktobra sta se pri Gavgamelah, blizu Niniv srečali Aleksandrova in Darejeva vojska. Aleksandrova vojska je štela z okrepitvami vred 40.000 pešakov in 7.000 konjenikov, Darejeva pa naj bi štela 200.000 pešakov in 45.000 konjenikov ter 200 bojnih voz s kosami na kolesih.

Perzijci so najprej poslali v napad bojne vozove, ki naj bi povzročili zmedo v makedonski falangi, vendar so lokostrelci postrelili večino voznikov bojnih vozov, tako da so preplašeni konji zbezljali iz bojišča. Perzijska konjenica je na obeh krilih krenila v napad, da bi obkolila Makedonce. Vsakemu izmed makedonskih kril je priskočila na pomoč falanga, tako da je v falangi nastala vrzel. Perzijska konjenica pa je, namesto da bi napadla boke in hrbet falange, krenila skozi vrzel, proti makedonskemu taboru z namenom, da ga oropa. Tračani, ki so branili tabor, so uspeli napad odbiti, medtem pa je del falange obrnil fronto in osvobodil tabor. S tem se je sreča obrnila na stran Makedoncev: pehota in konjenica sta v sodelovanju premagali perzijsko levo krilo in razbili center. Ko je Darej III zaslutil poraz, je zopet pobegnil z bojišča. Na bojišču naj bi obležalo okoli 40.000 Perzijcev in le 500 Makedoncev, čeprav je ta podatek malo verjeten. Makedonci so zasegli tudi zakladnico s 4.000 talenti srebra (od 75 do 100 ton).

Perzijski kralj Darej III se je po bolečem porazu umaknil v Ekbatano, Aleksander pa je nadaljeval pohod proti Babilonu, katerega je nato osvojil brez boja. V zahvalo je žrtvoval največjemu babilonskemu bogu Bel-Marduku in si s tem pridobil nekaj simpatij pri Perzijcih. Še pred koncem leta je Aleksander vkorakal v Suzo, kjer je zasegel nepojmljive zaklade: od 40.000 do 50.000 talentov (1.000 do 1.250 ton) zlata in še 9.000 talentov (225 ton) darikov - Darejevih zlatnikov.